KIT ELISA ARN double brin (ARNdb)

Ce kit est un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) couplé au système biotine-streptavidine, pour la mesure quantitative des ARNdb d'une longueur supérieure à 60 paires de bases (pb), quelle que soit la séquence.La plaque a été pré-enduite d’anticorps anti-ARNdb.L'ARNdb présent dans l'échantillon est ajouté et se lie aux anticorps recouvrant les puits.Ensuite, un anticorps anti-ARNdb biotinylé est ajouté et se lie à l’ARNdb dans l’échantillon.Après lavage, la HRP-Streptavidine est ajoutée et se lie à l'anticorps anti-ARNdb biotinylé.Après incubation, la HRP-streptavidine non liée est éliminée.Ensuite, la solution de substrat TMB est ajoutée et catalysée par HRP pour produire un produit de couleur bleue qui s'est transformé en jaune après l'ajout d'une solution d'arrêt acide.La densité du jaune est proportionnelle à la quantité cible d’ARNdb capturée dans la plaque.L'absorbance est mesurée à 450 nm.

Application

Ce kit est destiné à la mesure quantitative de l’ARNdb résiduel.

Composants du kit

Stockage et stabilité

1. Pour le kit inutilisé : L’ensemble du kit peut être stocké à une température de 2 à 8 ℃ pendant sa durée de conservation.Une lumière forte doit être évitée pour la stabilité du stockage.

2. Pour le kit utilisé : Une fois la microplaque ouverte, veuillez couvrir les puits inutilisés avec un scellant pour plaque et remettre dans la pochette en aluminium contenant le sachet déshydratant, fermer la pochette en aluminium avec une fermeture éclair et la remettre à 2 ~ 8 ℃ dès que possible après utilisation.Les autres réactifs doivent être remis à 2 ~ 8 ℃ dès que possible après utilisation.

Matériel requis mais non fourni

1. Lecteur de microplaques avec filtre 450 ± 10 nm (mieux s'il peut détecter à une longueur d'onde de 450 et 650 nm).

2. Agitateur de microplaques.

3. Embouts et tubes à centrifuger sans RNase.

Organigramme des opérations

Avant que tu commences

1. Amenez tous les composants et échantillons du kit à température ambiante (18-25 ℃) avant utilisation.Si le kit n'est pas utilisé en une seule fois, veuillez retirer uniquement les bandelettes et les réactifs pour l'expérience en cours et laisser les bandelettes et les réactifs restants dans l'état requis.

2. Tampon de lavage : diluez 40 ml de tampon de lavage concentré 20× avec 760 ml d'eau déionisée ou distillée pour préparer 800 ml de tampon de lavage 1×.

3. Standard : essorez ou centrifugez brièvement la solution mère avant utilisation.La concentration des quatre standards fournis est de 5ng/μL.Pour les standards UTP et pUTP dsRNA, veuillez diluer la solution mère à 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0pg/μL avec le tampon STE pour tracer la courbe standard.Pour les standards N1-Me-pUTP dsRNA, veuillez diluer la solution mère à 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0pg/μL avec un tampon STE pour tracer la courbe standard.Pour le standard 5-OMe-UTP dsRNA, veuillez diluer la solution mère à 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL avec un tampon STE pour tracer la courbe standard.Nous recommandons que les normes puissent être diluées comme dans les tableaux suivants :

4. Anticorps de détection biotinylé et solution de travail HRP-streptavidine : essorez ou centrifugez brièvement la solution mère avant utilisation.Diluer-les à la concentration de travail avec du tampon de dilution.

5. Sous-état TMB : aspirez la dose nécessaire de solution avec des embouts stérilisés et ne versez plus la solution résiduelle dans le flacon.Le substrat TMB est sensible à la lumière, ne pas exposer le substrat TMB à la lumière pendant une longue période.

Utilisation du protocole

1. Déterminez le nombre de bandelettes requis pour le test.Insérez les bandes dans les cadres pour les utiliser.Les bandes de plaques restantes non utilisées dans cet essai doivent être reconditionnées dans le sac avec un déshydratant.Fermez hermétiquement le sac pour le conserver au réfrigérateur.

2. Ajoutez 100 μL de chacune des dilutions d'étalon, de blanc et d'échantillons dans les puits appropriés.Couvrir avec le scellant pour plaque.Incuber 1h à température ambiante sous agitation à 500 tr/min.Les échantillons doivent être dilués avec le tampon STE à la concentration appropriée pour un test précis.

3. Étape de lavage : Aspirez la solution et lavez avec 250 μL de tampon de lavage dans chaque puits et laissez reposer pendant 30 s.Jeter complètement le tampon de lavage en enclenchant la plaque sur du papier absorbant.Laver totalement 4 fois.

4. Ajoutez 100 μL de solution de travail d’anticorps de détection biotinylé dans chaque puits.Couvrir avec le scellant pour plaque.Incuber 1h à température ambiante sous agitation à 500 tr/min.

5. Répétez l’étape de lavage.

6. Ajoutez 100 μL de solution de travail HRP-streptavidine dans chaque puits.Couvrir avec le scellant pour plaque.Incuber 30 minutes à température ambiante sous agitation à 500 tr/min.

7. Répétez l'étape de lavage.

8. Ajoutez 100 μL de solution de substrat TMB dans chaque puits.Couvrir avec le scellant pour plaque.Incuber 30 min à TA Protéger de la lumière.Le liquide deviendra bleu par l'ajout de solution de substrat.

9. Ajoutez 50 μL de solution d'arrêt dans chaque puits.Le liquide deviendra jaune par l'ajout de solution d'arrêt.Exécutez ensuite le lecteur de microplaques et effectuez immédiatement la mesure à 450 nm.

Calcul des résultats

1. Faites la moyenne des lectures en double pour chaque étalon, contrôle et échantillons et soustrayez la densité optique moyenne de l'étalon zéro.Construisez une courbe standard avec l’absorbance sur l’axe vertical (Y) et la concentration d’ARNdb sur l’axe horizontal (X).

2. Il est recommandé d'effectuer le calcul avec un logiciel d'ajustement de courbe informatisé tel que Curve Expert 1.3 ou ELISA Calc dans un modèle d'ajustement non linéaire à 5 ou 4 paramètres.

Performance

1. Sensibilité :

limite inférieure de détection : ≤ 0,001pg/μL (pour UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (pour 5-OMe-UTP-dsRNA).

limite inférieure de quantification : 0,0156 pg/μL (pour UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (pour N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (pour 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Précision : CV de l'intra-essai ≤10 %, CV de l'inter-essai ≤10 %

3. Récupération : 80 % ~ 120 %

4. Linéarité : 0,0156-0,5pg/μL (pour UTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL (pourN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL (pour 5-OMe-UTP-dsRNA).

Considérations

1. La température et le temps de réaction du TMB sont critiques, veuillez les contrôler strictement selon les instructions.

2. Afin d'obtenir une bonne reproductibilité et sensibilité du test, un lavage approprié des plaques pour éliminer l'excès de réactifs n'ayant pas réagi est essentiel.

3. Tous les réactifs doivent être soigneusement mélangés avant utilisation et éviter les bourdonnements lors de l'ajout de l'échantillon ou des réactifs.

4. Si des cristaux se sont formés dans le tampon de lavage concentré (20x), réchauffez-le à 37 ℃ et mélangez doucement jusqu'à ce que les cristaux soient complètement dissous.

5. Évitez de tester des échantillons contenant de l'azide de sodium (NaN3), car cela pourrait détruire l'activité HRP, entraînant une sous-estimation de la quantité d'ARNdb.

6. Évitez la contamination par la RNase pendant le test.

7. L'étalon/l'échantillon, la détection des anticorps et le SA-HRP peuvent également être effectués à température ambiante sans agitation, mais cela peut entraîner une diminution d'un facteur de la sensibilité de détection.Dans ce cas, nous recommandons que les standards d’ARNdb UTP et pUTP soient dilués à partir de 2pg/μL, les standards d’ARNdb N1-Me-pUTP doivent être dilués à partir de 4pg/μL et l’étalon d’ARNdb 5-OMe-UTP doit être dilué à partir de 8pg/μL.De plus, incubez la solution de travail HRP-streptavidine pendant 60 minutes à température ambiante.N'utilisez pas d'agitateur de flacon, car l'agitateur de flacon peut entraîner des résultats inexacts.

Résultat typique

1. Données de courbe standard

2. Calcul de la courbe standard

3. Plage de détection du revêtement : 0,0312- 1pg/μL