Transcriptase inverse M-MLV Neoscript
Neoscript Reverse Transcriptase est une transcriptase inverse obtenue par criblage de mutations du gène M-MLV de l'origine et de l'expression du virus de la leucémie murine Moloney dans E.coli.L'enzyme supprime l'activité de la RNase H, a une tolérance à la température plus élevée et convient à la transcription inverse à haute température.Par conséquent, il est utile pour éliminer les effets défavorables de la structure de haut niveau de l’ARN et des facteurs non spécifiques sur la synthèse de l’ADNc, et présente une stabilité et une capacité de synthèse de transcription inverse plus élevées.L'enzyme a une plus grande stabilité et une capacité de synthèse par transcription inverse.
Composants
1.Transcriptase inverse Neoscript de 200 U/μL
2.5 × tampon de premier brin (facultatif)
* 5 × Le tampon premier brin ne contient pas de dNTP, veuillez ajouter des dNTP lors de la préparation du système de réaction
Application recommandée
1.qRT-PCR en une étape.
2.Détection des virus à ARN.
Condition de stockage
-20°C pour un stockage à long terme, doit être bien mélangé avant utilisation, éviter les cycles de congélation-dégel fréquents.
Définition de l'unité
Une unité incorpore 1 nmol de dTTP en 10 minutes à 37°C en utilisant du poly(A)•oligo(dT)25comme modèle/amorce.
Contrôle de qualité
1.Pureté électrophorétique SDS-PAGE supérieure à 98 %.
2.Sensibilité d'amplification, contrôle de lot à lot, stabilité.
3.Aucune activité nucléase exogène, aucune endonucléase exogène ou contamination par exonucléase
Configuration de la réaction pour la première solution de réaction en chaîne
1.Préparation du mélange réactionnel
| Composants | Volume |
| Oligo(dT)12-18 Apprêt ou amorce aléatoireun Ou des amorces spécifiques aux gènesb | 50 pmoles |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmoles | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Modèle d'ARN | ARN total ≤ 5 μg ;ARNm≤ 1 μg |
| DH sans RNase2O | À 10 µL |
Remarques:a/b : Veuillez sélectionner différents types d’amorces en fonction de vos besoins expérimentaux.
2.Chauffer à 65°C pendant 5 minutes et refroidir rapidement sur de la glace pendant 2 minutes.
3.Ajoutez les composants suivants au système ci-dessus jusqu'à un volume total de 20 µL et mélangez doucement :
| Composants | Volume (µL) |
| 5 × tampon de premier brin | 4 |
| Transcriptase inverse Neoscript (200 U/μL) | 1 |
| Inhibiteur de RNase (40 U/μL) | 1 |
| DH sans RNase2O | À 20 µL |
4.Veuillez effectuer la réaction selon les conditions suivantes :
(1) Si Random Primer est utilisé, la réaction doit être effectuée à 25 ℃ pendant 10 minutes, puis à 50 ℃ pendant 30 à 60 minutes ;
(2) Si Oligo dT ou des amorces spécifiques sont utilisées, la réaction doit être effectuée à 50 ℃ pendant 30 à 60 minutes.
5.Chauffer à 95 ℃ pendant 5 minutes pour inactiver la Neoscript Reverse Transcriptase et terminer la réaction.
6.Les produits de transcription inverse peuvent être utilisés directement dans la réaction PCR et la réaction PCR quantitative de fluorescence, ou stockés à -20 ℃ pendant une longue période.
PCR Rréaction：
1.Préparation du mélange réactionnel
| Composants | Concentration |
| 10 × Tampon PCR (sans dNTP, sans Mg²+) | 1× |
| dNTP (10 mM chacun dNTP) | 200 µM |
| 25 mM de MgCl2 | 1-4 mM |
| ADN polymérase Taq (5U/μL) | 2-2,5U |
| Amorce 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Amorce 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Modèleun | ≤10 % de la première solution de réaction en chaîne (2 μL) |
| ddH2O | À 50 µL |
Remarques:a : Si trop de solution de première réaction en chaîne est ajoutée, la réaction PCR peut être inhibée.
2.Procédure de réaction PCR
| Étape | Température | Temps | Cycles |
| Pré-dénaturation | 95 ℃ | 2-5 minutes | 1 |
| Dénaturation | 95 ℃ | 10-20 secondes | 30-40 |
| Recuit | 50-60 ℃ | 10-30 secondes | |
| Extension | 72 ℃ | 10-60 secondes |
Remarques
1.Convient pour l'optimisation de la température de transcription inverse dans la plage de 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Il a une meilleure stabilité et convient à l’amplification par transcription inverse à haute température.De plus, il est favorable au passage efficace à travers des régions structurelles complexes de l’ARN.Aussi, ilconvient à la détection RT-PCR quantitative par fluorescence multiplex en une étape.
3.Bonne compatibilité avec diverses enzymes d'amplification PCR et convient aux réactions RT-PCR de haute sensibilité.
4.Convient à la réaction RT-PCR quantitative de fluorescence en une étape à haute sensibilité, améliore efficacement le taux de détection de faible concentration de modèles.
5.Convient à la construction de bibliothèques d'ADNc.
