ARNm Cap2'-O-méthyltransférase

L'ARNm Cap 2´ -O-méthyltransférase est dérivé d'une souche recombinante d'E. coli qui porte le gène de l'ARNm de la vaccine Cap 2 ´-O-Méthyltransférase.Cette enzyme ajoute un groupe méthyle à la position 2´-O du premier nucléotide adjacent à la structure de la coiffe à l'extrémité 5´ de l'ARN. L'enzyme utilise la S-adénosylméthionine (SAM) comme donneur de méthyle pour méthyler l'ARN coiffé (cap -0) résultant en une structure cap-1.

La structure Cap1 peut augmenter l'efficacité de la traduction, améliorant ainsi l'expression de l'ARNm dans les expériences de transfection et de microinjection. Cette enzyme nécessite spécifiquement un ARN avec une coiffe m7GpppN comme substrat.Il ne peut pas utiliser d'ARN avec pN, ppN, pppN ou GpppN à l'extrémité 5'.L'ARN coiffé peut être préparé via une transcription in vitro à l'aide d'un analogue de capuchon ou par coiffage enzymatique à l'aide de l'enzyme de coiffage de la vaccinia.

Composants

ARNm Cap 2´-O-méthyltransférase (50U/μL)

10 × tampon de réaction de plafonnement

Stockage

-25 ～- 15 ℃ pour le stockage (Évitez les cycles répétés de gel-dégel)

Tampon de stockage

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0, 25 ℃), NaCl 100 mM, DTT 1 mM, EDTA 0, 1 mM, 0, 1 % Triton X- 100, 50 % glycérol.

Définition de l'unité

Une unité est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour méthyler 10 pmoles de transcrit d'ARN coiffé de 80 nt en 1 heure à 37°C.

Tests de contrôle de qualité

Exonucléase: 50 U d'ARNm Cap 2 ´ -O-Méthyltransférase avec 1 μg d'ADN de digestion λ-Hind III à 37 ℃ pendant 16 heures ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

Endonucléase: 50 U d'ARNm Cap 2 ´ -O-Méthyltransférase avec 1 µg d'ADN λ à 37 ℃ pendant 16 heures ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

Nickase: 50 U d'ARNm Cap 2 ´ -O-Méthyltransférase avec 1 µg de pBR322 à 37 ℃ pendant 16 heures ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

RNase: 50 U d'ARNm Cap 2 ´ -O-Méthyltransférase avec 1,6 μg d'ARN MS2 pendant 4 heures à 37 ℃ ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

E. coli ADN: 50U d'ARNm Cap 2 ´ -O-Méthyltransférase sont criblées pour la présence deE. coli ADN génomique utilisant la qPCR TaqMan avec des amorces spécifiques duE. coli Locus de l’ARNr 16S.LeE. coli la contamination de l'ADN génomique est =1E. coli génome.

Bactérien Endotoxine: Test LAL, selon la Pharmacopée chinoise IV édition 2020, méthode de test de limite de gel, règle générale (1143).La teneur en endotoxines bactériennes doit être =10 UE/mg.

Système et conditions de réaction

1. Combinez une quantité appropriée d’ARN coiffé et de H2O sans RNase dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL jusqu’à obtenir un volume final de 16,0 µL.

2. Chauffer à 65℃ pendant 5 minutes suivi d'un bain de glace pendant 5 minutes.

3. Ajoutez les composants suivants dans l’ordre spécifié (pour la méthylation de l’ARN coiffé

moins de 10

*10 × Tampon de réaction de coiffage : Tris-HCl 500 mM (pH 8,0, 25 ℃), KCl 50 mM, MgCl2 10 mM 、 DTT 10 mM.

4. Incuber à 37℃ pendant 1 heure (2 heures d'incubation sont recommandées pour le fragment cible inférieur à 200 nt).

Applications

Améliorer l’expression de l’ARNm lors des expériences de microinjection et de transfection.

Notes d'utilisation

1. Avant la réaction, l’ARN doit être purifié et dissous dans de l’eau sans nucléase, toutes les solutions ne doivent contenir ni EDTA ni ions.

2. Il est recommandé de chauffer l'échantillon d'ARN à 65 ℃ pendant 5 minutes avant la réaction pour éliminer la structure secondaire à l'extrémité 5 de la transcription.Elle pourrait être étendue à 10 minutes pour une structure complexe à 5 ´-terminaux.