Enzyme de coiffage du virus de la vaccine

L'enzyme de coiffage du virus de la vaccine est dérivée d'une souche recombinante d'E. coli qui porte les gènes de l'enzyme de coiffage du virus de la vaccine.Cette enzyme unique est composée de deux sous-unités (D1 et D12) et possède trois activités enzymatiques (ARN triphosphatase et guanylyltransférase par la sous-unité D1 et guanine méthyltransférase par la sous-unité D12).L'enzyme de coiffage du virus de la vaccine est efficace pour catalyser la formation d'une structure de coiffe, qui peut spécifiquement attacher la structure de coiffe 7-méthylguanylate (m7Gppp, Cap 0) à l'extrémité 5' de l'ARN.La structure Cap (Cap 0) joue un rôle important dans la stabilisation, le transport et la traduction de l'ARNm chez les eucaryotes.Le coiffage de l’ARN par réaction enzymatique est une méthode efficace et simple qui peut améliorer considérablement la stabilité et la traduction de l’ARN pour la transcription, la transfection et la microinjection in vitro.

Composants

Enzyme de coiffage du virus de la vaccine (10 U/μL)

10 × tampon de plafonnement

Conditions de stockage

-25～- 15℃ pour le stockage (Évitez les cycles répétés de gel-dégel)

Tampon de stockage

Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM,

1 mM DTT, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 % Triton X-100, 50 % glycérol.

Définition de l'unité

Une unité d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour incorporer 10 pmol de GTP dans un transcrit de 80 nt en 1 heure à 37°C.

Contrôle de qualité

Exonucléase :10 U d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine avec 1 μg d'ADN de digestion λ-Hind III à 37 ℃ pendant 16 heures ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

Endonucléase :10 U d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine avec 1 μg d'ADN λ à 37 ℃ pendant 16 heures ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

Nickase :10 U d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine avec 1 µg de pBR322 à 37 ℃ pendant 16 heures ne donnent aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

RNase :10 U d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine avec 1,6 μg d'ARN MS2 pendant 4 heures à 37 ℃ ne produit aucune dégradation, comme déterminé par électrophorèse sur gel d'agarose.

1.ADN de coli :10U d'enzyme de coiffage du virus de la vaccine sont criblées pour détecter la présence d'ADN génomique d'E. coli à l'aide de la qPCR TaqMan avec des amorces spécifiques du locus d'ARNr 16S d'E. coli.La contamination de l'ADN génomique d'E. coli est ≤1 du génome d'E. coli.

2.Bactérien Endotoxine: Test LAL, selon la Pharmacopée chinoise IV édition 2020, méthode de test de limite de gel, règle générale (1143).La teneur en endotoxines bactériennes doit être ≤ 10 UE/mg.

Système et conditions de réaction

1. Protocole de capsulage (volume de réaction : 20 μL)

Cette procédure est applicable à la réaction de coiffage de 10 µg d’ARN (≥100 nt) et peut être étendue en fonction des exigences expérimentales.

I) Combiner 10 µg d’ARN et H2O sans nucléase dans un tube microfuge de 1,5 ml jusqu’à un volume final de 15,0 µL.*10 × Tampon de coiffage : Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH 8,0)

2) Chauffer à 65 ℃ pendant 5 minutes suivi d'un bain de glace pendant 5 minutes.

3) Ajoutez les composants suivants dans l'ordre spécifié

*10 × Tampon de coiffage : Tris-HCl 0,5 M, KCl 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, (25 ℃, pH8,0)

4) Incuber à 37°C pendant 30 minutes, l'ARN est maintenant bouché et prêt pour les applications en aval.

Borne 2. 5′ réaction de marquage (volume de réaction : 20 µL)

Ce protocole est conçu pour marquer l’ARN contenant un 5´ triphosphate et il peut être étendu en fonction des demandes.L’efficacité de l’incorporation du marqueur sera affectée par le rapport molaire ARN : GTP, ainsi que par la teneur en GTP dans les échantillons d’ARN.

1) Combinez la quantité appropriée d’ARN et de H2O sans nucléase dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml jusqu’à un volume final de 14,0 µL.

2) Chauffer à 65 ℃ pendant 5 minutes suivi d'un bain de glace pendant 5 minutes.

3) Ajoutez les composants suivants dans l’ordre spécifié.

** GTP MIX fait référence au GTP et à un petit nombre de marqueurs.Pour la concentration de GTP, reportez-vousà la note 3.

4) Incuber à 37°C pendant 30 minutes, l'extrémité 5' de l'ARN est maintenant étiquetée et prête à être utilisée en aval.

Applications

1. Coiffage de l'ARNm avant les tests de traduction/traduction in vitro

2. Marquage de l'extrémité 5' de l'ARNm

Notes d'utilisation

1.Le chauffage de la solution d'ARN avant l'incubation avec l'enzyme de coiffage de la vaccinia élimine la structure secondaire à l'extrémité 5' de la transcription.Prolongez la durée jusqu'à 60 minutes pour les transcriptions dont les 5'ends sont connus et hautement structurés.

2. L'ARN utilisé pour les réactions de coiffage doit être purifié avant utilisation et mis en suspension dans de l'eau exempte de nucléases.L'EDTA ne doit pas être présent et la solution doit être exempte de sels.

3. Pour marquer l’extrémité 5´, la concentration totale de GTP doit être d’environ 1 à 3 fois la concentration molaire d’ARNm dans la réaction.

4. Le volume du système de réaction peut être augmenté ou réduit en fonction du volume réel.