2 × Sensi Direct Premix-UNG (Sonde qPCR)
Numéro de catalogue : HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) est conçu pour effectuer une PCR directement à partir d'échantillons sans extraction d'ADN ni préparation d'échantillons.Ce réactif est constitué d'ADN polymérase à démarrage à chaud, d'ADN glycosylase d'uracile (UNG), d'inhibiteur de RNase, de MgCl2, dNTP (avec dUTP au lieu de dTTP) et stabilisants, pour la PCR quantitative (qPCR).Ce réactif présente une tolérance élevée aux inhibiteurs et peut donc être directement appliqué à la détection d'échantillons tels que des prélèvements de gorge, de la salive, du sang total anticoagulé, du plasma et du sérum sans extraction d'ADN.Le réactif utilise un tampon exclusif pour la qPCR avec des enzymes mixtes d'ADN polymérase anti-inhibitrice et d'enzyme UNG.Par conséquent, il peut obtenir une bonne amplification des gènes cibles dans des échantillons contenant des inhibiteurs et inhiber l’amplification faussement positive provoquée par la pollution résiduelle et par aérosol de PCR.Ce réactif est compatible avec la plupart des instruments PCR quantitatifs fluorescents, tels que Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche, etc.
Composants
1. 50 × Mélange SensiDirect Enzyme/UNG
2. 2 × tampon de prémélange SensiDirect (dUTP)
Conditions de stockage
Tous les composants doivent être conservés à -20 ℃ pour un stockage à long terme et à 4 ℃ pendant 3 mois maximum.Veuillez bien mélanger après décongélation et centrifuger avant utilisation.Évitez les gels-dégels fréquents.
Protocole de cyclisme
| Étape | Température | Temps | Faire du vélo |
| Digestion | 50℃ | 2 minutes | 1 |
| Activation de la polymérase | 95 ℃ | 1-5min | 1 |
| Dénaturer | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Recuit/Extension | 56-64 ℃ | 20-60 ans |
Instructions de pipetage
| Réactif | Volume par réaction | Volume par réaction | Concentration finale |
| 2 × tampon de prémélange SensiDirect (dUTP) | 12,5µL | 25µL | 1× |
| 50 × Mélange SensiDirect Enzyme/UNG | 0,5µL | 1µL | 1× |
| 25 × mélange amorce-sonde1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Échantillon3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volume total | 25 µL | 50 μL | - |
1. La concentration finale de l'apprêt est généralement de 0,2 μM.Pour de meilleurs résultats, la concentration de l'amorce peut être optimisée dans la plage de 0,2 à 1 μM.
2. Généralement, la concentration de la sonde peut être optimisée dans la plage de 0,1 à 0,3 μM.La concentration optimale de la sonde est liée à l'instrument d'amplification PCR en temps réel, au type de sonde et au type de substance de marquage fluorescente.Veuillez vous référer au manuel de l'instrument ou aux exigences spécifiques de chaque sonde fluorescente.
3. Différents types d'échantillons contiennent différents types et contenus d'inhibiteur et nombre de copies du gène cible.Le volume de l'échantillon doit être pris en compte en fonction des conditions réelles.Effectuer une dilution de l'échantillon en ajoutant de l'eau exempte de nucléases ou du tampon TE, si nécessaire.
4. Volume recommandé de différents échantillons :
| Échantillon | Volume pour un 50 µL réaction | Maximum rapport |
| Sang total anticoagulé | 2,5 μL | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30% |
| Sérum | 10 μL | 20% |
| Écouvillonnage de la gorge | 10 μL | 20% |
| Salive | 10 μL | 20% |
Contrôle de qualité
1. Détection de fonction : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qPCR.
2. Aucune activité nucléase exogène : pas de pollution exogène par endonucléase et exonucléase.
Notes de produit
1. Ce produit utilise un nouveau type d'ADN polymérase à démarrage à chaud, qui peut être activé en 1 à 5 minutes. Puisque son tampon de réaction a été optimisé, il est plus approprié pour la PCR quantitative à fluorescence double ou multiple utilisant la méthode de la sonde.
2. Si la valeur Rn de l'amplification PCR est trop faible ou si l'amplification est manifestement inhibée, la diminution de la quantité d'échantillon, l'augmentation du volume de réaction ou la dilution précédente de l'échantillon peuvent améliorer les résultats.
3. Le prélèvement de sang, de salive, d'urine, d'écouvillonnage de gorge, etc. doit respecter les exigences des critères cliniques, et un échantillon frais peut être utilisé pour prévenir la dégradation de l'acide nucléique.
4. Étant donné que différents amplicons ont une efficacité d'utilisation différente de celle du dUTP et une sensibilité à l'UNG, les réactifs doivent être optimisés si la sensibilité de détection diminue lors de l'utilisation du système UNG.Veuillez nous contacter pour une assistance technique si nécessaire.
5. Pour éviter l’amplification des produits PCR résiduels entre les réactions en une étape, une zone expérimentale dédiée et une pipette sont nécessaires à l’amplification.Opérez avec des gants et changez-les fréquemment et n'ouvrez pas le tube de réaction après l'amplification PCR.
