5 × Neoscript Fast RT-qPCR Premix plus-UNG
Numéro de catalogue : HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (Probe qRT-PCR) est un mélange hautement stable à base de sonde à tube unique, adapté à la transcription inverse en une étape et à la PCR quantitative (qRT-PCR).Il prend en charge le pré-mélange des amorces et des sondes et reste stable après un stockage prolongé à basse température.L’échantillon à tester peut être ajouté directement lors de l’utilisation, sans opération supplémentaire d’ouverture du tube/pipetage.Ce produit fournit des composants, par exemple l'ADN polymérase à démarrage à chaud, le M-MLV, l'ADN glycosylase d'uracile thermolabile (TS-UNG), l'inhibiteur de RNase, le MgCl.2, dNTP (avec dUTP au lieu de dTTP) et stabilisateurs.Avec la transcriptase inverse et l’ADN polymérase à amplification rapide génétiquement modifiées, il est possible de terminer l’amplification PCR en 20 à 40 minutes.Ce réactif utilise un tampon spécial pour la qPCR avec des enzymes mixtes d'enzyme d'amplification anti-inhibitrice et d'enzyme UNG.Par conséquent, il peut obtenir une bonne amplification des gènes cibles et empêcher une fausse amplification causée par la pollution résiduelle et par aérosol de PCR.Ce réactif est compatible avec la plupart des instruments de PCR quantitative à fluorescence de fabricants tels que Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad et Roche.
Composant
1.25 × Mélange Neoscript Fast RTase/UNG
2.5 × tampon de prémélange Neoscript Fast RT (dUTP)
Conditions de stockage
Tous les composants doivent être conservés à -20 ℃ pour un stockage à long terme et à 4 ℃ pendant 3 mois maximum.Veuillez bien mélanger après décongélation et centrifuger avant utilisation.Évitez les gels-dégels fréquents.
Préparation du système de réaction qRT-PCR
| Composants | 25µLSystème | 50µLSystème | Concentration finale |
| 5 × tampon de prémélange Neoscript Fast RT (dUTP) | 5μL | 10μL | 1× |
| 25 × Mélange Neoscript Fast RTase/UNG | 1μL | 2μL | 1× |
| 25 × mélange amorce-sondea | 1μL | 2μL | 1× |
| Modèle d'ARNb | – | – | – |
| ddH2O | Jusqu'à 25 μL | Jusqu'à 50 μL | – |
1) a. La concentration finale de l'amorce est généralement de 0,2 μM.Pour de meilleurs résultats, la concentration de l'amorce peut être optimisée dans la plage de 0,2 à 1 μM.Généralement, la concentration de la sonde peut être optimisée dans la plage de 0,1 à 0,3 μM.
2) b.Lors de l'utilisation d'une procédure PCR rapide, l'augmentation de la concentration des amorces et des sondes peut entraîner de meilleurs résultats d'amplification et leur rapport doit être optimisé en conséquence.
3) Différents types d'échantillons contiennent différents types et contenus d'inhibiteur et nombre de copies du gène cible.Le volume de l'échantillon doit être pris en compte en fonction des conditions réelles.Effectuer une dilution de l'échantillon avec de l'eau exempte de nucléases ou du tampon TE, si nécessaire.
Réaction Cconditions
| Procédure PCR régulière | Procédure PCR rapide | ||||||
| Procédure | Temp. | Temps | Faire du vélo | Procédure | Temp. | Temps | Faire du vélo |
| Transcription inversée | 50℃ | 10-20 minutes | 1 | Transcription inversée | 50℃ | 5 minutes | 1 |
| Polymérase Activation | 95 ℃ | 1-5 minutes | 1 | Polymérase Activation | 95 ℃ | années 30 | 1 |
| Dénaturation | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 | Dénaturation | 95 ℃ | 1-3s | 40-50 |
| Recuit et Extension | 56-64 ℃ | 20-60 ans | Recuit et Extension | 56-64 ℃ | 3-20s | ||
Contrôle de qualité
1.Détection fonctionnelle : sensibilité, spécificité et répétabilité de la qPCR.
2.Pas d'activité nucléase exogène : pas de pollution par endonucléase et exonucléase exogène.
Remarques
1.Le taux d'amplification de l'ADN polymérase rapide n'est pas inférieur à 1 Ko/10 s.Différents instruments PCR ont des vitesses de chauffage et de refroidissement, des modes de contrôle de la température et une conductivité thermique différents. Il est donc essentiel d'optimiser la concentration de votre amorce/sonde et votre méthode d'exécution en combinaison avec votre instrument PCR rapide spécifique.
2.Ce produit présente une large applicabilité et convient au diagnostic moléculaire à haute sensibilité.La méthode PCR en trois étapes est recommandée pour les amorces à faible température d’hybridation ou pour l’amplification de fragments longs de plus de 200 pb.
3.Étant donné que différents amplicons ont une efficacité d'utilisation différente du dUTP et une sensibilité différente à l'UNG, les réactifs doivent être optimisés si la sensibilité de détection diminue lors de l'utilisation du système UNG.Veuillez nous contacter pour une assistance technique si nécessaire.
4.Pour éviter l’amplification des produits PCR résiduels, une zone expérimentale dédiée et une pipette sont nécessaires à l’amplification.Opérez avec des gants et changez-les fréquemment et n'ouvrez pas le tube PCR après l'amplification.
