Transcriptase inverse RTL
La transcriptase inverse RTL est une ADN polymérase dépendante de la matrice d'ARN qui est dépourvue de l'activité exonucléase 3' → 5' et possède une activité RNase H.Cette enzyme peut utiliser l'ARN comme matrice pour synthétiser un brin complémentaire d'ADN, qui peut être appliqué à la synthèse d'ADNc du premier brin, en particulier pour la RT-LAMP (amplification isotherme à médiation en boucle).Par rapport à la transcriptase inverse RTL 1.0, la sensibilité est considérablement améliorée, la stabilité thermique est plus forte et la réaction à 65°C est plus stable.La transcriptase inverse RTL (sans glycérol) peut être utilisée pour préparer des préparations lyophilisées, des réactifs RT-LAMP lyophilisés, etc.
Définition de l'unité
Une unité incorpore 1 nmol de dTTP dans un matériau précipitable à l'acide en 20 minutes à 50°C en utilisant du poly(A)•oligo(dT)25 comme matrice-amorce.
Composants
| Composant | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| Transcriptase inverse RTL (sans glycérol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| Tampon RTL 10×HC | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Condition de stockage
Transport sous 0°C et stockage entre -25°C~-15°C.
Contrôle de qualité
- Activité résiduelle deEndonucléase :Une réaction de 50 μL contenant 1 μg d’ADN λ et 15 unités de RTL2.0 incubée pendant 16 heures à 37 ℃ montre le même schéma qu’un contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
- Activité résiduelle deExonucléase:Une réaction de 50 μL contenant 1 μg d'ADN λ digéré par Hind Ⅲ et 15 unités de RTL2.0 incubées pendant 16 heures à 37 ℃ montre le même schéma que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
- Activité résiduelle deNickase:Une réaction de 50 μL contenant 1 μg de pBR322 superenroulé et 15 unités de RTL2.0 incubées pendant 4 heures à 37°C montre le même schéma que le contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
- Activité résiduelle deRNase:Une réaction de 10 μL contenant 0,48 μg d'ARN MS2 et 15 unités de RTL2.0 incubée pendant 4 heures à 37°C montre le même schéma qu'un contrôle négatif par électrophorèse sur gel.
- E. coli gADN :Mesuré avecE. colikits de détection HCD spécifiques, 15 unités de RTL2.0 contiennent moins de 1E. coligénome.
Configuration de la réaction
Protocole de synthèse d'ADNc
| Composants | Volume |
| Modèle d'ARN a | facultatif |
| Oligo (dT) 18 ~ 25 (50 uM) ou mélange d'amorces aléatoires (60 uM) | 2 µL |
| Mélange dNTP (10 mM chacun) | 1 μL |
| Inhibiteur de la RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| Transcriptase inverse RTL 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| Tampon RTL 10×HC | 2 µL |
| Eau sans nucléases | Jusqu'à 20 µL |
Remarques:
1) La posologie recommandée d’ARN total est de 1ng~1μg
2) La dose recommandée d'ARNm était de 50 ng à 100 ng.
Thermos-cyclisme Conditions pour une routine réaction:
| Température (°C) | Temps |
| 25 °Ca | 5 minutes |
| 55 °C | 10 minutesb |
| 80 °C | 10 minutes |
Remarques:
1) Si Random Primer Mix est utilisé, une étape d’incubation à 25°C.
2) Si un mélange d'amorces cible est utilisé, une étape d'incubation à 55°C pendant 10 à 30 minutes.
Protocole RT-LAMP
| Composants | Volume | Concentration finale |
| Modèle d'ARN | facultatif | ≥10 exemplaires |
| Mélange dNTP (10 mM) | 3,5 μL | 1,4 millimètre |
| Amorces FIP/BIP (25×) | 1 μL | 1,6 µM |
| Amorces F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 µM |
| Amorces LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 µM |
| Inhibiteur de RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Réaction |
| Transcriptase inverse RTL 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U/Réaction |
| ADN polymérase Bst V2 (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Réaction |
| MgSO4 (100 mM) | 1,5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| Tampon RTL 10 × HC (ou tampon 10 × HC Bst V2) | 2,5 μL | 1 × (2 mM Mg2+) |
| Eau sans nucléases | Jusqu'à 25 µL | - |
Remarques:
1) Mélanger au vortex et centrifuger brièvement pour recueillir.Incubation à température constante à 65°C pendant 1 heure.
2) Les deux buffers sont interopérables et ont la même composition.
Remarques
1. Ce produit formera un solide blanc lorsqu'il est stocké à -20 °C.Sortez-le de -20°C et mettez-le sur la glace pendant environ 10 minutes.Après fusion, il peut être utilisé en secouant et en mélangeant.
2.Le produit ADNc peut être conservé à -20°C ou -80°C ou utilisé immédiatement pour la réaction PCR.
3.Pour éviter la contamination par la RNase, veuillez garder la zone expérimentale propre et porter des gants et des masques propres pendant le fonctionnement.
