Kit Maxi Plasmide EndoFree
Ce kit convient à l'extraction de 150 à 300 ml de solution bactérienne cultivée pendant la nuit, en utilisant une méthode améliorée de lyse alcaline SDS pour lyser les bactéries.L'extrait brut est combiné sélectivement avec un piégeur d'endotoxines unique et séparé par centrifugation pour éliminer les endotoxines.Ensuite, la membrane de gel de silice se lie sélectivement à l'ADN plasmidique dans la solution dans des conditions de sel élevé et de pH faible.Ceci est suivi par l'ajout d'un tampon de lavage pour éliminer les impuretés et autres composants bactériens.Enfin, un tampon d’élution à faible teneur en sel et à pH élevé est utilisé pour éluer l’ADN plasmidique pur de la membrane matricielle en silicium.La membrane de gel de silice utilise une membrane d'adsorption spéciale, et la différence de quantité d'adsorption entre la colonne et la colonne est très faible et la répétabilité est bonne.Le phénol, le chloroforme et d’autres réactifs toxiques ne sont pas nécessaires, pas plus que les étapes de précipitation à l’éthanol.Ce kit peut être utilisé pour extraire rapidement 0,2 à 1,5 mg d'ADN plasmidique pur à haut nombre de copies, avec un taux d'extraction de 80 % à 90 %.Le kit utilise une formule de processus unique qui élimine l'endotoxine, la teneur en endotoxine est extrêmement faible et l'effet de transfection cellulaire est excellent.Le plasmide extrait pourrait être directement utilisé dans la digestion enzymatique, la PCR, la transcription in vitro, la transformation, le séquençage et d’autres expériences de biologie moléculaire.
Conditions de stockage
La RNaseA doit être stockée entre -30 et -15 ℃ et transportée à ≤0 ℃.
Endotoxin Scavenger peut être stocké à 2 ~ 8 ℃ pendant un mois, stocké à -30 ~ -15 ℃ pour un stockage à long termeet transporté à ≤0℃.
Les autres composants doivent être stockés à température ambiante (15 ~ 25 ℃) et transportés à température ambiante.
Composants
| Composants | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Tampon P1 | 75 ml |
| Tampon P2 | 75 ml |
| Tampon P4 | 75 ml |
| Chasseur d'endotoxines | 25 ml |
| Mot de passe du tampon | 2 × 22 ml |
| Tampon TB | 20 ml |
| Colonnes FastPure DNA Maxi (chacune dans un tube de prélèvement de 50 ml) | 10 |
| Tube de prélèvement sans endotoxine | 2 × 5 |
RNaseA :10 mg/ml, utilisé pour éliminer l'ARN.
Tampon P1 :tampon de suspension bactérienne, ajoutez la RNaseA au tampon P1 avant la première utilisation.
Tampon P2 :tampon de lyse bactérienne (contenant du SDS/NaOH).
Tampon P4 :tampon neutralisant.
Éliminateur d'endotoxines :éliminer efficacement l'endotoxine de l'extrait plasmidique brut.
Mot de passe du tampon :tampon de lavage, ajoutez le volume d'éthanol stipulé avant la première utilisation.
Tampon TB :tampon d'élution.
Colonnes FastPure DNA Maxi :colonnes d'adsorption d'ADN plasmidique.
Tubes de prélèvement 50 ml :tubes de collecte de filtrat.
Tube de prélèvement sans endotoxine :tubes de collecte d'ADN plasmidique.
Matériaux préparés
Éthanol absolu, isopropanol, tubes à centrifuger à fond rond de 50 ml et 50 ml sans endotoxinetubes à centrifuger.
Applications
Ce produit convient à l'extraction à grande échelle de plasmides à partir de 150 à 300 ml de solution bactériennecultivé pendant la nuit.
Processus d'expérimentation
1. Prélever 150 à 200 ml (pas plus de 300 ml) de solution bactérienne cultivée pendant une nuit et centrifuger àenviron 11 000 tr/min (12 000 × g) pendant 1 à 2 min.Jeter le surnageant et collecter les bactéries.
Δ Lors de la collecte de plus de 50 ml de solution bactérienne, les bactéries peuvent être collectées en ajoutant une solution bactérienne, en centrifugant, en jetant le surnageant et d'autres étapes dans le même tube de 50 ml pour
plusieurs fois.
2. Ajoutez 7,5 ml de tampon P1 (veuillez vérifier si la RNaseA a été ajoutée au tampon P1) dans la centrifugeuse.tube contenant des bactéries et mélanger soigneusement au vortex ou au pipetage.
Δ La remise en suspension complète des bactéries au cours de cette étape est essentielle au rendement, et il ne devrait y avoir aucun amas bactérien après la remise en suspension.S’il y a des amas bactériens qui ne sont pas bien mélangés, cela affectera la lyse, entraînant un faible rendement et une faible pureté.Si la DO600 de la solution bactérienne est de 0,65, il est recommandé d'utiliser 7,5 ml de tampon P1 lors de l'extraction de 150 ml de solution bactérienne ;lorsque la DO600 est de 0,75, 8 ml de tampon P1 doivent être utilisés et les volumes des tampons P2 et P4 doivent être modifiés en conséquence.Si le volume de la solution bactérienne est augmenté à 200 ml, il est recommandé deLe volume des tampons P1, P2 et P4 soit augmenté proportionnellement.
3. Ajoutez 7,5 ml de Buffer P2 à la suspension bactérienne de l'étape 2 et mélangez doucement de haut en bas pendant 6 à 8 minutes.fois et incuber à température ambiante pendant 4 à 5 minutes.
Δ Retourner délicatement pour bien mélanger.Le vortex provoquera la fragmentation de l’ADN génomique, ce qui entraînera la formation de fragments d’ADN génomique dans le plasmide extrait.A ce moment, la solution devient visqueuse et translucide, indiquant que les bactéries ont été entièrement lysées.La durée ne doit pas dépasser 5 min pour éviter la destruction des plasmides.Si la solution n'est pas claire, il se peut qu'il y ait trop de bactéries, ce quilyse incomplète, la quantité de bactéries doit donc être réduite de manière appropriée.
4. Ajoutez 7,5 ml de tampon P4 à la suspension bactérienne de l'étape 3 et retournez immédiatement doucement 6 à 8 fois pour permettre à la solution de neutraliser complètement le tampon P2.A ce moment, un précipité floculant blanc devrait apparaître.Centrifuger à plus de 11 000 tr/min (12 000 × g) pendant 10 à 15 min, pipeter soigneusement le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger à fond rond de 50 ml (auto-préparé) et éviteraspirer le précipité blanc flottant.
Δ Ajouter le tampon P4 et inverser immédiatement pour bien mélanger.Laisser le tube reposer jusqu'à ce que le précipité blanc soit réparti uniformément dans la solution pour éviter la production de précipitations locales qui pourraient affecter la neutralisation.S'il n'y a pas de précipité floculant blanc uniforme avant la centrifugation et que le surnageant n'est pas clair après centrifugation, le tube peut êtrecentrifugé pendant encore 5 minutes.
5. Ajouter 0,1 fois le volume (10 % du volume du surnageant, environ 2,2 ml) d'Endotoxin Scavenger au surnageant de l'étape 4 et inverser pour mélanger.Placez la solution dans un bain de glace ou insérez-la dans de la glace pilée (ou dans un réfrigérateur-congélateur) pendant 5 minutes jusqu'à ce que la solution passe de trouble à claire et transparente (ou encorelégèrement trouble), et mélanger occasionnellement plusieurs fois.
Δ Une fois l'Endotoxin Scavenger ajouté au surnageant, le surnageant deviendra trouble mais lele surnageant doit devenir clair (ou légèrement trouble) après refroidissement dans le bain de glace.
6. Une fois le surnageant placé à température ambiante (>25℃) pendant 10 à 15 minutes, il deviendra trouble à mesure quesa température augmente jusqu'à la température ambiante.Ensuite, le surnageant doit être inversé pour être mélangé.
Δ Si la température ambiante est inférieure ou si vous souhaitez réduire le temps d'extraction, le surnageant peut être incubé dans un bain-marie à 37 ~ 42 ℃ pendant 5 à 10 minutes et l'étape suivante peut être effectuée après le surnageant.devient trouble.
7. Centrifuger le surnageant à environ 11 000 tr/min (12 000 × g) pendant 10 min à température ambiante (la température doit être >25 ℃) pour séparer la phase.La phase aqueuse supérieure contient l'ADN tandis que la couche inférieure de phase huileuse bleue contient des endotoxines et d'autres impuretés.Transférer lephase aqueuse contenant de l'ADN dans un nouveau tube etjeter la couche huileuse.
Δ La température pendant la centrifugation doit être supérieure à 25 ℃ car une séparation de phase efficace ne le fait pas.se produire si la température est trop basse.
Δ Si la séparation des phases n'est pas efficace, la température de centrifugation peut être ajustée à 30 ℃ etle temps de centrifugation peut être augmenté jusqu'à 15 min.
Δ N'aspirez pas la couche huileuse bleue car elle contient des endotoxines et d'autres impuretés.
Mécanisme
Remise en suspension Lyse Neutralisation
◇ Ajouter 7,5 ml de tampon P1
◇ Ajouter 7,5 ml de tampon P2
◇ Ajouter 7,5 ml de Tampon P4
Élimination des endotoxines
◇Ajoutez 0, 1 fois le volume surnageant d'Endotoxin Scavenger
Reliure et lavage
◇ Ajouter 0,5 fois le volume d'isopropanol
◇ Ajouter 10 ml de tampon PW
◇ Ajouter 10 ml de tampon PW
Élution
◇ Ajoutez 1 à 2 ml de tampon TB ou de ddH2O sans endotoxine
