Kit PCR direct en usine

Numéro de catalogue : HCR2020A

Le kit Plant Direct PCR convient à l’amplification directe des feuilles, des graines, etc. des plantes, et peut être utilisé pour le criblage à haut débit d’échantillons de plantes qui ne contiennent pas de polysaccharides ni de polyphénols.L'ADN polymérase à amplification directe basée sur l'évolution dirigée présente une tolérance supérieure aux inhibiteurs de PCR dans les plantes.Parallèlement, il maintient des performances d'amplification élevées, adaptées à l'amplification de fragments d'ADN de moins de 5 kb.Le tampon de lyse A unique du kit peut être utilisé pour lyser des tissus végétaux frais ou congelés.Il est facile à utiliser et le lysat peut être utilisé comme modèle pour l’amplification sans purification.Le système contient des agents protecteurs qui permettent d’amplifier efficacement les échantillons bruts après des congélations et décongélations répétées.2 × Plant Direct Master Mix n'a besoin que d'ajouter des amorces et des modèles pour effectuer la réaction d'amplification, réduisant ainsi les opérations de pipetage et améliorant le débit de détection et la reproductibilité des résultats.

Composants

*Plant Direct Lysis Buffer B est un réactif facultatif, qui est utilisé pour neutraliser le Plant Direct Lysis Buffer A afin de prolonger la durée de stockage des échantillons.Il peut être utilisé en fonction de la situation réelle.

Conditions de stockage

2 × Plant Direct Master Mix, conserver à -30 ~ -15 ℃ et éviter les congélations et décongélations répétées ;Tampon de lyse directe pour plantes, conserver à -30 ~ -15 ℃ ou 2 ~ 8 ℃.

Processus d'expérimentation

Traitement des échantillons–Feuille de plante

Méthode directe:Il est recommandé d'utiliser des jeunes feuilles.Utilisez une perforatrice d'un diamètre fixe de 0,5 à 3 mm pour obtenir un échantillon petit et uniforme, puis ajoutez directement l'échantillon au système PCR (un système de 50 μl est recommandé).Attention, assurez-vous que l’échantillon se trouve dans la solution PCR et non contre la paroi du tube.Si la PCR directe est utilisée pour amplifier des fragments longs et des échantillons complexes, l’utilisation d’un échantillon de plus petit diamètre (0,5 à 1 mm) comme modèle peut aider à obtenir de meilleurs résultats.

Méthode de lyse par broyage :Il est recommandé d'utiliser des jeunes feuilles.Prenez un petit morceau de feuille (environ 1 à 3 mm de diamètre), placez-le dans 20 μl de Plant Direct Lysis Buffer Ab et broyez-le autant que possible (cette étape peut être effectuée en pressant la feuille avec un embout de pipette de 100 μl). pour écraser l'échantillon).Si de plus grands volumes de tissus foliaires sont utilisés (ne dépassez pas 7 mm), augmentez le volume de tampon de dilution à 50 μl.Une fois les feuilles broyées, la solution doit apparaître verte.Après une brève centrifugation, ajoutez 1 μl du surnageant au système PCR comme modèle de réactionc.

Méthode de lyse thermique :Il est recommandé d'utiliser des jeunes feuilles.Prenez un petit morceau de feuille (environ 1 à 3 mm de diamètre), placez-le dans 20 µl de tampon de lyse directe Plant A et chauffez-le à 95 °C pendant 5 à 10 min.Le temps de lyse peut être prolongé de manière appropriée pour les feuilles difficiles à lyser (pas plus de 20 minutes).Si de plus grands volumes de tissus foliaires sont utilisés (ne dépassez pas 7 mm), augmentez le volume de tampon de dilution à 50 μl.Après chauffage, centrifugez brièvement et ajoutez 1 μl de surnageant au système PCR comme modèle de réactionb.

Traitement des échantillons–Graine de plante

Méthode de lyse par broyage :Utilisez un scalpel pour couper les graines d'un diamètre de 5 mm, ajoutez-les à 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A et broyez l'échantillon avec une pointe de pipette ou d'autres outils.Vortexer brièvement et laisser reposer à température ambiante pendant 3 à 5 minutes.Assurez-vous que l’échantillon de graines est immergé dans le tampon de dilution.Après une brève centrifugation, ajoutez 1 μl du surnageant au système PCR comme modèle de réaction.

Méthode de lyse thermique :Utilisez un scalpel pour couper les graines d’un diamètre de 5 mm, ajoutez-les à 100 μl de Plant Direct Lysis Buffer A et chauffez à 95°C pendant 5 à 10 min.Le temps de lyse peut être prolongé de manière appropriée pour les feuilles difficiles à lyser (pas plus de 30 minutes).Après chauffage, centrifugez brièvement et ajoutez 1 μl de surnageant au système PCR comme modèle de réactionb.

un.Des ciseaux ou d’autres outils peuvent également être utilisés pour découper des échantillons de taille appropriée ;si le poinçon ou les ciseaux sont réutilisés, ils doivent être nettoyés avec une solution d'hypochlorite de sodium à 2 % avant chaque utilisation afin d'éviter toute contamination croisée entre les échantillons.

b.Assurez-vous que le tampon de lyse Plant Direct est complètement fondu avant utilisation.Si le tampon est visqueux ou présente des précipités, il peut être chauffé à 37 ℃ pour le faire fondre complètement avant utilisation.

c.Le volume de matrice dans le système réactionnel peut être ajusté de manière appropriée en fonction de la différence entre le volume de matière végétale et le diluant ajouté.

Tampon de lyse directe des plantes

Le tampon de lyse directe A contenu dans ce produit a été strictement optimisé pour libérer le génome de la plupart des tissus végétaux et convient au stockage à court terme de plantes brutes à 4 ℃.Si l'échantillon doit être conservé pendant une période plus longue (par exemple 1 à 2 mois), il est recommandé de transférer le surnageant dans un nouveau tube EP et de le conserver à -20 ℃.Pour stocker les échantillons de manière plus stable, ajoutez un volume égal de Plant Direct Lysis Buffer B au surnageant transféré, mélangez bien et conservez à -20 ℃.La durée de stockage stable varie selon les échantillons et les états des plantes.

Système de réaction

un.Il contient du Mg²⁺à une concentration finale de 2 mM.

b.Il est recommandé d'utiliser une concentration finale de 0,4 μM pour chaque amorce.L’utilisation excessive d’amorces entraînera une augmentation de l’amplification non spécifique.

c.La quantité d'échantillon utilisée peut être ajustée en fonction de la situation réelle.La quantité utilisée dans une seule réaction d’échantillon brut lysé peut être ajustée entre 2 % et 20 % du volume total de la réaction.Utiliser trop d’échantillons peut entraîner un échec de l’amplification.

Programme de réaction

un.La dénaturation initiale (98 ℃, 5 min) favorise la lyse des tissus végétaux, libérant l'ADN génomique qui peut être utilisé pour l'amplification PCR.Ne réduisez pas le temps et ne diminuez pas la température.

b.Il est recommandé de le régler égal à la valeur Tm de l'amorce ou 2 ~ 4 ℃ supérieur à la valeur Tm.L'ADN polymérase à amplification directe utilisée dans ce produit est différente de l'ADN polymérase Taq conventionnelle et présente des exigences particulières en matière de température de recuit de réaction ; l'utilisation d'une température de recuit élevée peut réduire efficacement l'amplification non spécifique et améliorer l'efficacité de l'amplification.Pour les modèles complexes, une amplification efficace peut être obtenue en ajustant la température de recuit et en prolongeant le temps d'extension.

c.Si la longueur du produit d'amplification est ≤ 1 Ko, le temps d'extension est fixé à 30 secondes/Ko ;si la longueur du produit d'amplification est >1 ko, le temps d'extension est fixé à 60 sec/ko.

d.Pour les échantillons complexes ou les échantillons avec un faible rendement d'amplification, le nombre de cycles peut être augmenté de manière appropriée jusqu'à 40 à 50 cycles.

Applications

Il s’applique à l’amplification directe des tissus végétaux et au criblage à haut débit d’échantillons végétaux ne contenant pas de polysaccharides ni de polyphénols.

Remarques

Pour usage de recherche uniquement.Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.

1. Pour l'amplification végétale brute ou l'amplification directe, il est recommandé d'utiliser de l'ADN génomique purifié comme contrôle positif avant de commencer l'expérience afin de garantir que le système, les amorces et les opérations sont corrects.

2. L'ADN polymérase à amplification directe utilisée dans ce kit a une forte activité de relecture.Si un clonage TA doit être effectué, il est recommandé de purifier l’ADN avant d’ajouter l’adénine.

3. Guide de conception de l'amorce :

un.Il est recommandé que la dernière base à l’extrémité 3’ de l’amorce soit G ou C.

b.Les mésappariements consécutifs doivent être évités dans les 8 dernières bases à l’extrémité 3’ de l’amorce.c.Évitez les structures en épingle à cheveux à l’extrémité 3’ de l’amorce.

d.Les différences dans la valeur Tm de l'amorce directe et de l'amorce inverse ne doivent pas dépasser 1 ℃ et la valeur Tm doit être ajustée à 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 est recommandé pour calculer la valeur Tm).

e.Les séquences d’amorces supplémentaires qui ne correspondent pas au modèle ne doivent pas être incluses lors du calcul de la valeur Tm de l’amorce.

F.Il est recommandé que la teneur en GC de l'amorce soit comprise entre 40 % et 60 %.

g.La répartition globale de A, G, C et T dans l'amorce doit être aussi uniforme que possible.Évitez d’utiliser des régions à contenu élevé en GC ou AT.

h.Évitez la présence de séquences complémentaires de 5 bases ou plus soit au sein de l'amorce, soit entre deux amorces et évitez la présence de séquences complémentaires de 3 bases ou plus à l'extrémité 3' de deux amorces.

je.Utilisez la fonction NCBI BLAST pour vérifier la spécificité de l’amorce afin d’éviter une amplification non spécifique.