Protéinase K NGS (poudre)
Numéro de catalogue : HC4507A
NGS Protease K est une sérine protéase stable avec une activité enzymatique élevée et une large spécificité de substrat. L'enzyme décompose préférentiellement les liaisons ester et les liaisons peptidiques adjacentes au C-terminal des acides aminés hydrophobes, des acides aminés contenant du soufre et des acides aminés aromatiques.Ainsi, il est souvent utilisé pour dégrader les protéines en peptides courts.NGS Protease K est une sérine protéase typique avec l'Asp39-Son69-Ser224triade catalytique qui est unique aux sérine protéases, et le centre catalytique est entouré d'étoupe de Ca2+sites de liaison pour la stabilisation, maintenant une activité enzymatique élevée dans une gamme plus large de conditions.
spécification
| Apparence | Poudre amorphe blanche à blanc cassé, lyophilisée |
| Activité spécifique | ≥40U/mg solide |
| DNase | Aucun détecté |
| RNase | Aucun détecté |
| Biocharge | ≤50CFU/g de solide |
| Résidu d'acide nucléique | <5pg/mg solide |
Propriétés
| Source | Album Tritirachium |
| Numéro CE | 3.4.21.64(Recombinant de l'album Tritirachium) |
| Masse moléculaire | 29 kDa (SDS-PAGE) |
| Point isoelectrique | 7.81 Fig.1 |
| pH optimal | 7,0-12,0 (Tous exercent une activité élevée) Fig.2 |
| Température optimale | 65 ℃ Fig.3 |
| Stabilité du pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16h) Fig.4 |
| Stabilité thermique | En dessous de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig.5 |
| La stabilité au stockage | Stocké à 25 ℃ pendant 12 mois Fig.6 |
| Activateurs | SDS, urée |
| Inhibiteurs | Fluorophosphate de diisopropyle ;fluorure de benzylsulfonyle |
Conditions de stockage
Conservez la poudre lyophilisée à -25 ~ -15 ℃ pendant une longue période à l'abri de la lumière ;Après dissolution, aliquoter dans un volume approprié pour un stockage à court terme à 2-8℃ à l'abri de la lumière ou un stockage à long terme à -25~-15℃ à l'abri de la lumière.
Précautions
Portez des gants et des lunettes de protection lors de l'utilisation ou de la pesée, et restez bien aéré après utilisation.Ce produit peut provoquer une réaction allergique cutanée et une grave irritation des yeux.En cas d'inhalation, il peut provoquer des symptômes d'allergie, d'asthme ou une dyspnée.Peut provoquer une irritation respiratoire.
Définition de l'unité
Une unité de NGS Protease K est définie comme la quantité d’enzyme nécessaire pour hydrolyser la caséine en 1 µmol de L-tyrosine dans des conditions de détermination standard.
Préparation des réactifs
| Réactif | Fabricant | Catalogue |
| Caséine techniquedu lait de vache | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 20040618 |
| Acide trichloroacetic | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 80132618 |
| L'acétate de sodium | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 10018818 |
| Acide acétique | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 10011018 |
| Le carbonate de sodium | Sinopharm ChimiqueRéactif Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phénol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tyrosine | Sigma | 93829 |
Réactif I :
Substrat : 1 % de caséine provenant d'une solution de lait de vache : dissoudre 1 g de caséine de lait de vache dans 50 ml de solution de phosphate de sodium 0,1 M, pH 8,0, chauffer au bain-marie à 65-70 °C pendant 15 minutes, remuer et dissoudre, refroidir avec de l'eau, ajusté en hydroxyde de sodium jusqu'à pH 8,0 et diluer à 100 ml.
Réactif II :
Solution de TCA : acide trichloroacétique 0,1 M, acétate de sodium 0,2 M et acide acétique 0,3 M (peser successivement 1,64 g d'acide trichloroacétique + 1,64 g d'acétate de sodium + 1,724 ml d'acide acétique, ajouter 50 ml d'eau déminéralisée, ajuster avec du HCl à pH 4,03 et diluer dans 100 ml).
Réactif III :
0,4 m de solution de carbonate de sodium (peser 4,24 g de carbonate de sodium anhydre et dissoudre dans 100 ml d'eau)
Réactif IV :
Réactif Folin phénol : diluer 5 fois avec de l'eau déminéralisée.
Réactif V :
Diluant enzymatique : solution de phosphate de sodium 0,1 M, pH 8,0.
Réactif VI :
Solution standard de L-tyrosine : 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de L-tyrosine dissoute avec 0,2 M de HCl.
Procédure
1. Allumez le spectrophotomètre UV-Vis et sélectionnez la mesure photométrique.
2. Réglez la longueur d'onde sur 660 nm.
3. Allumez le bain-marie, réglez la température à 37 ℃, assurez-vous que la température reste inchangée pendant 3 à 5 minutes.
4. Préchauffer 0,5 ml de substrat dans un tube à centrifuger de 2 ml au bain-marie à 37 ℃ pendant 10 minutes.
5. Extrayez 0,5 ml de solution enzymatique diluée dans le tube à centrifuger préchauffé pendant 10 minutes.Définir le diluant enzymatique comme groupe vierge.
6. Ajouter 1,0 mL de réactif TCA immédiatement après la réaction.Bien mélanger et incuber au bain-marie pendant 30 minutes.
7. Centrifuger la solution réactionnelle.
8. Ajoutez les composants suivants dans l'ordre spécifié.
| Réactif | Volume |
| Surnageant | 0,5 ml |
| Carbonate de sodium 0,4 M | 2,5 ml |
| Réactif Folin phénol | 0,5 ml |
9. Bien mélanger avant d'incuber au bain-marie à 37℃ pendant 30 minutes.
10. DO660a été déterminé comme OD1;Groupe témoin vierge : un diluant enzymatique est utilisé pour remplacer la solution enzymatique afin de déterminer la DO660comme DO2, ΔOD=OD1-OD2.
11. Courbe standard de L-tyrosine : 0,5 ml de solution de L-tyrosine à différentes concentrations, 2,5 ml de carbonate de sodium 0,4 M, 0,5 ml de réactif phénol Folin dans un tube à centrifuger de 5 ml, incuber à 37 ℃ pendant 30 minutes, détecter la DO660pour différentes concentrations de L-tyrosine, puis obtenu la courbe standard Y=kX+b, où Y est la concentration de L-tyrosine, X est la DO600.
Calcul
2 : Volume total de solution réactionnelle (mL)
0,5 : Volume de solution enzymatique (mL)
0,5 : Volume de liquide réactionnel utilisé dans la détermination chromogénique (mL)
10 : Temps de réaction (min)
Df: Dilution multiple
C: Concentration enzymatique (mg/mL)
Les figures
Fig.1 Résidu d'ADN
| Échantillon | Avenue C4 | Acide nucléique Récupération (pg/mg) | Récupération(%) | Total Nucléique Acide ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| MST1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| MST2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| MST4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O sans ARN | Indéterminé | — | — | — |
Fig.2 pH optimal
Fig.3 Température optimale
Fig.4 Stabilité du pH
Fig.5 Stabilité thermique
Fig.6 Stabilité de stockage à 25℃
