Protéinase K mNGS (liquide)
La protéinase K est une sérine protéase stable avec une large spécificité de substrat.Il dégrade de nombreuses protéines à l’état natif même en présence de détergents.Les preuves issues d'études sur la structure cristalline et moléculaire indiquent que l'enzyme appartient à la famille des subtilisines avec une triade catalytique à site actif (Asp39-Son69-Ser224).Le site de clivage prédominant est la liaison peptidique adjacente au groupe carboxyle des acides aminés aliphatiques et aromatiques avec des groupes alpha-aminés bloqués.Il est couramment utilisé pour sa large spécificité.Cette protéinase K est spécialement conçue pour le mNGS.Comparée à l’autre protéinase K, elle contient encore moins de contamination par les acides nucléiques avec les mêmes performances enzymatiques, ce qui pourrait mieux garantir l’application du mNGS en aval.
Conditions de stockage
2-8 ℃ pendant 2 ans
spécification
| Apparence | Liquide incolore à brun clair |
| Activité | ≥800 U/ml |
| Concentration en protéines | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Aucun détecté |
| DNase | Aucun détecté |
| RNase | Aucun détecté |
Propriétés
| Numéro CE | 3.4.21.64(Recombinant de l'album Tritirachium) |
| Point isoelectrique | 7,81 |
| pH optimal | 7,0- 12,0 Fig.1 |
| Température optimale | 65 ℃ Fig.2 |
| Stabilité du pH | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 h) Fig. 3 |
| Stabilité thermique | En dessous de 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Fig. 4 |
| La stabilité au stockage | Plus de 90 % d'activité pendant 12 mois à 25 ℃ |
| Activateurs | SDS, urée |
| Inhibiteurs | Fluorophosphate de diisopropyle ;fluorure de phénylméthylsulfonyle |
Applications
1. Kit de diagnostic génétique
2. Kits d'extraction d'ARN et d'ADN
3. Extraction de composants non protéiques des tissus, dégradation des impuretés protéiques, telles que l'ADNvaccins et préparation d'héparine
4. Préparation de l'ADN chromosomique par électrophorèse pulsée
5. Western blot
6. Réactifs d’albumine enzymatique glycosylée diagnostic in vitro
Précautions
Portez des gants et des lunettes de protection lors de l'utilisation ou de la pesée, et restez bien aéré après utilisation.Ce produit peut provoquer une réaction allergique cutanée et une grave irritation des yeux.En cas d'inhalation, il peut provoquer des symptômes d'allergie, d'asthme ou une dyspnée.Peut provoquer une irritation respiratoire.
Définition de l'unité
Une unité (U) est définie comme la quantité d'enzyme nécessaire pour hydrolyser la caséine afin de produire 1 μmoltyrosine par minute dans les conditions suivantes.
Préparation des réactifs
Réactif I : 1 g de caséine de lait a été dissous dans 50 ml de solution de phosphate de sodium 0,1 M (pH 8,0), incubé dans de l'eau à 65-70 ℃ pendant 15 minutes, agité et dissous, refroidi par de l'eau, ajusté par de l'hydroxyde de sodium à pH 8,0 et volume fixe 100 ml.
Réactif II : acide trichloroacétique 0,1 M, acétate de sodium 0,2 M, acide acétique 0,3 M.
Réactif III : 0,4 M Na2CO3solution.
Réactif IV : Réactif Forint dilué avec de l'eau pure 5 fois.
Réactif V : Diluant enzymatique : solution de phosphate de sodium 0,1 M (pH 8,0).
Réactif VI : solution de tyrosine : 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml de tyrosine dissoute avec 0,2MHCl.
Procédure
1. 0,5 ml de réactif I est préchauffé à 37 ℃, ajouter 0,5 ml de solution enzymatique, bien mélanger et incuber à37 ℃ pendant 10 minutes.
2. Ajoutez 1 ml de réactif II pour arrêter la réaction, mélangez bien et poursuivez l'incubation pendant 30 minutes.
3. Centrifuger la solution réactionnelle.
4. Prendre 0,5 ml de surnageant, ajouter 2,5 ml de réactif III, 0,5 ml de réactif IV, bien mélanger et incuber à 37 ℃pendant 30 minutes.
5. DO660a été déterminé comme OD1;groupe témoin à blanc : 0,5 ml de réactif V est utilisé pour remplacer l'enzymesolution pour déterminer la DO660comme DO2, ΔOD=OD1-OD2.
6. Courbe standard de L-tyrosine : 0,5 ml de solution de L-tyrosine à différentes concentrations, 2,5 ml de réactif III, 0,5 ml de réactif IV dans un tube à centrifuger de 5 ml, incuber à 37 ℃ pendant 30 minutes, détecter la DO660pour différentes concentrations de L-tyrosine, puis obtenu la courbe standard Y=kX+b, où Y est la concentration de L-tyrosine, X est la DO600.
Calcul
2 : Volume total de solution réactionnelle (mL)
0,5 : Volume de solution enzymatique (mL)
0,5 : Volume de liquide réactionnel utilisé dans la détermination chromogénique (mL)
10 : Temps de réaction (min)
Df: Dilution multiple
C: Concentration enzymatique (mg/mL)
Les références
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23h77.
2. Wieger U et Hilz H. Biochem.Biophysique.Rés.Commun.(1971) ;44:513.
3. Hilz, H.et coll.,EUR.J. Biochimie.(1975);56 : 103-108.
4. Sambrook J.et Al., Clonage moléculaire : manuel de laboratoire, 2e édition, Cold Spring HarborPresse de laboratoire, Cold Spring Harbor (1989).
Les figures
figue.1 Optimum pH
Solution tampon 100 mM : pH 6,0-8,0, phosphate de Na ;pH8,0-9,0, Tris-HCl ;pH9,0-12,5, Glycine-NaOH. Concentration enzymatique : 1 mg/mL
Fig.2 Température optimale
Réaction dans un tampon K-phosphate 20 mM pH 8,0.Concentration enzymatique : 1 mg/mL
Fig.3 pH La stabilité
25 ℃, 16 h de traitement avec une solution tampon 50 mM : pH 4,5-5,5, acétate ;pH 6,0-8,0, Na-phosphate ;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Concentration enzymatique : 1 mg/mL
Fig.4 Thermique la stabilité
Traitement de 30 minutes avec un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 8,0.Concentration enzymatique : 1 mg/mL
Fig.5 Stockage stablety at 25 ℃
