Mini kit d'extraction d'ADN
Ce kit adopte un système tampon optimisé et une technologie de purification sur colonne de gel de silice, qui peuvent récupérer des fragments d'ADN de 70 pb à 20 kb à partir de diverses concentrations de gel d'agarose TAE ou TBE.La colonne d'adsorption d'ADN peut spécialement adsorber l'ADN dans des conditions riches en sel.De plus, le kit peut purifier directement les fragments d'ADN des produits de PCR, des systèmes de réaction enzymatiques ou des produits d'ADN bruts obtenus par d'autres méthodes, et éliminer les impuretés telles que les protéines, d'autres composés organiques, les ions de sels inorganiques et les amorces oligonucléotidiques.Cela peut garantir que la purification peut être terminée en 10 à 15 minutes.L'ADN purifié peut être utilisé directement pour la ligature, la transformation, la digestion enzymatique, la transcription in vitro, la PCR, le séquençage, la microinjection, etc.
Conditions de stockage
Conserver entre -15 et -25 ℃ et transporter à température ambiante.
Composants
| Composants | (100 reçus) |
| PIB tampon | 80 ml |
| Tampon GW | 2 × 20 ml |
| Tampon d'élution | 20 ml |
| Mini-colonnes FastPure DNA-G | 100 |
PIB tampon :Tampon de liaison à l'ADN.
Tampon GW :Tampon de lavage ;ajouter de l'éthanol absolu selon le volume indiqué sur le flacon avant utilisation.
Tampon d'élution :Élution.
Mini-colonnes FastPure DNA-G :Colonnes d'adsorption d'ADN.
Tubes de prélèvement 2 ml :Tubes de collecte pour filtrat.
Matériaux préparés
Tubes stérilisés de 1,5 ml, éthanol absolu et isopropanol (lorsque fragment d'ADN ≤ 100 pb, ajouter 1 volume
isopropanol pour 1 volume de gel), bain-marie.
Processus d'expérimentation
Ajouter 80 ml d'éthanol pour diluer le Buffer GW comme indiqué sur l'étiquette avant utilisation, conserver à température ambiante.
Mécanisme
1. Solution de réaction PCR
Schéma d'extraction sur gel : Ajouter un volume égal de tampon GDP Schéma de récupération de la solution de réaction PCR :Ajouter 5 fois le volume du tampon
2. PIB Calculer le volume de gel(100 μl équivaut à 100 mg )
Dissoudre le gel
3. Préchauffer à 50 ~ 55℃
4. Lavage de reliure
Ajoutez 300 μL de Buffer GDP*
Ajouter 700 μL de Buffer GW
Ajouter 700 μL de Buffer GW
5. Éluer
Ajouter 20 à 30 μL de tampon d'élution ou d'eau déionisée
Remarques* Récupération du liquide de réaction PCR sans cette étape
Programme d'extraction de gel
1. Après l’électrophorèse de l’ADN pour fractionner les fragments d’ADN, excisez la seule bande de fragment d’ADN du gel d’agarose sous lumière UV.Il est recommandé d'utiliser du papier absorbant pour absorber l'humidité apparente du gel et minimiser la taille de la tranche de gel en éliminant autant que possible l'excès d'agarose.Peser la tranche de gel (sans tube de microcentrifugeuse) pour calculer son volume : Le volume de 100 mg de tranche de gel est d'environ 100 μL, en supposant que la densité est de 1 g/ml.
2. Ajoutez un volume égal de tampon GDP, incubez à 50 ~ 55 ℃ pendant 7 à 10 min (en fonction de la taille du gel, ajustez le temps d'incubation jusqu'à ce que le gel soit complètement dissous).Retourner le tube 2 fois pendant l'incubation.
Δ L’ajout de 1 à 3 volumes de Buffer GDP n’influencera pas l’efficacité de la récupération de l’ADN.Si le fragment d'ADN à récupérer < 100 pb, 3 volumes de Buffer GDP doivent être ajoutés ;lorsque la tranche de gel est complètement dissoute, ajoutez 1 volume d'isopropanol et mélangez soigneusement, puis passez à l'étape suivante.
3. Centrifugez brièvement pour amener l'échantillon au fond du tube, insérez les mini-colonnes FastPure DNA-G dans les tubes de prélèvement de 2 ml, transférez soigneusement la solution au maximum de 700 μL une fois par an.
temps aux colonnes de filtration, centrifuger à 12 000 tr/min (13 800 X g) pendant 30 à 60 secondes.
4. Jeter le filtrat et ajouter 300 μL de Buffer GDP à la colonne, incuber à température ambiante pendant 1 min, centrifuger à 12 000 tr/min (13 800 X g) pendant 30 à 60 s.
5. Jetez le filtrat et ajoutez 700 μL de Buffer GW (vérifiez si de l'éthanol absolu a été ajouté au préalable !) à la colonne, centrifugez à 12 000 tr/min (13 800 X g) pendant 30 à 60 secondes.
Δ Veuillez ajouter du tampon GW autour de la paroi de la colonne d'adsorption, ou ajouter le couvercle arrière du tampon GW et mélanger à l'envers 2 à 3 fois pour aider à éliminer complètement le sel adhérant à la paroi du tube.
6. Répétez l'étape 5.
Δ Un rinçage avec le tampon GW deux fois peut garantir que le sel est complètement éliminé et éliminer l'impact sur les expériences ultérieures.
7. Jetez le filtrat et centrifugez la colonne vide à 12 000 tr/min (13 800 X g) pendant 2 min.
8. Insérez la colonne dans un tube de microcentrifugeuse propre de 1,5 ml, ajoutez 20 à 30 μL de tampon d'élution au centre de la membrane de la colonne, incubez pendant 2 min, puis centrifugez à 12 000 tr/min (13 800 X g) pendant 1 min.Jetez la colonne, stockez l’ADN obtenu à -20 .
Δ Transférer le surnageant de l'étape 8 dans la colonne pour éluer à nouveau et préchauffer le tampon d'élution à 55 (lorsque le fragment d'ADN > 3 kb) peut être utile pour augmenter l'efficacité de la récupération.
Programme de récupération des produits PCR
Ce protocole est applicable pour purifier les fragments d’ADN des produits PCR, du système de réaction enzymatique et d’autres produits bruts d’ADN (y compris l’ADN génétique).Cette solution peut éliminer efficacement divers nucléotides, amorces, dimères d'amorces, molécules de sel, enzymes et autres impuretés.
1. Centrifugez brièvement les produits de PCR, la solution de réaction enzymatique et d’autres produits bruts d’ADN.Estimer leur volume à la pipette et transférer dans un tube stérilisé de 1,5 ml ou 2 ml.Ajouter du ddH2O jusqu'à ce que le volume atteigne 100 μL ;tandis que pour l'ADN génomique à haute concentration, une dilution à 300 μL avec ddH2O contribuera à améliorer l'efficacité de la récupération.
2. Ajoutez 5 volumes de Buffer GDP, mélangez soigneusement en retournant ou en vortexant.Si le fragment d’ADN d’intérêt > 100 pb, 1,5 volumes supplémentaires (échantillons + Buffer GDP) d’éthanol doivent être ajoutés.
3. Réinsérez la colonne dans le tube de prélèvement, transférez le mélange dans la colonne, centrifugez à 12 000 tr/min (13 800 ×g) pendant 30 à 60 secondes.Si le volume de la solution mélangée est > 700 µL, remettez la colonne d'adsorption dans le tube de collecte, transférez la solution restante dans la colonne d'adsorption et centrifugez à 12 000 tr/min (13 800 × g) pendant 30 à 60 secondes.
4. La performance suivante fait référence aux étapes 5 à 8 du programme d'extraction 08-1/Gel.
Applications
Différentes concentrations de gel d'agarose TAE ou TBE ;Produits de PCR, systèmes de réaction enzymatique ou autres produits d'ADN brut obtenus par diverses méthodes.Les fragments récupérés allaient de70 pb -20 ko.
Remarques
Pour usage de recherche uniquement.Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic.
1. Ajouter 80 ml d'éthanol pour diluer le Buffer GW comme indiqué sur l'étiquette avant utilisation, conserver à température ambiante.
2. Si le tampon GDP précipite facilement pendant le stockage à basse température, il peut être placé à température ambiante pendant un certain temps avant utilisation.Si nécessaire, il peut être préchauffé dans un bain-marie à 37 ℃ jusqu'à ce que le précipité soit complètement dissous, puis il peut être utilisé après mélange.
3. Réglez la température du bain-marie à 50 ~ 55 ℃ à l'avance.
4. Dans l'étape 1 du programme d'extraction 08-1/Gel, minimiser la taille de la tranche de gel réduira considérablement le temps de dissolution et augmentera l'efficacité de la récupération (l'ADN linéarisé s'hydrolyse facilement lorsqu'il est continuellement exposé à haute température).N'exposez pas le gel d'ADN aux UV pendant une longue période, car la lumière ultraviolette peut endommager l'ADN.
5. Dissoudre complètement le gel dans l'étape 2 du programme d'extraction 08-1/Gel, sinon l'efficacité de la récupération de l'ADN sera sérieusement affectée.
6. Préchauffez le tampon d'élution ou ddH2O à 55 ℃, ce qui est utile pour améliorer l'efficacité de l'élution de l'ADN.Il est recommandé de conserver l’ADN dans un éluant de Tris-HCl 2,5 mM, pH 7,0 – 8,5.
