ADN glycosylase d'uracile
L'uracile-ADN glycosylase (UNG ou UDG) est un clone recombinant d'E.coli d'un poids moléculaire de 25 kDa.Il catalyse la libération d'uracile libre à partir de l'ADN simple brin et double brin contenant de l'uracile, est inactif contre l'ARN et peut être utilisé pour empêcher la contamination des produits d'amplification PCR.Le principe d'action est basé sur le fait que si le dUTP est remplacé par le dTTP dans la réaction PCR et qu'un produit d'amplification PCR contenant des bases dU est formé, l'enzyme peut rompre sélectivement la liaison glycosidique des bases U en simple brin et en double brin. L'ADN et dégradent le produit d'amplification PCR.
Application recommandée
Amplification de la prévention de la contamination
Condition de stockage
-20°C pour un stockage à long terme, doit être bien mélangé avant utilisation, éviter les cycles de congélation-dégel fréquents.
Tampon de stockage
Tris-HCl 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, stabilisant, glycérol à 50 %.
Définition de l'unité
La quantité d’enzyme nécessaire pour dégrader 1 µg d’ADN simple brin contenant des bases dU en 1 heure à 37°C est de 1 unité.
Contrôle de qualité
1.Pureté électrophorétique SDS-PAGE supérieure à 98 %
2.Sensibilité d'amplification, contrôle de lot à lot, stabilité
3.Après que 1U d'UNG ait été traité à 50 ℃ pendant 2 minutes, le modèle contenant U en dessous de 103 copies doit être complètement dégradé et aucun produit d'amplification ne peut être produit.
4.Aucune activité nucléase exogène
Instructions
| Composants | Volume (μL) | Concentration finale |
| 10 × Tampon PCR (sans dNTP, Mg²+gratuit) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 µM |
| dUTP (remplacer dTTP) | - | 200-600 µM |
| 25 mM de MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1,25U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × mélange d'apprêtun | 2 | 1× |
| Modèle | - | ＜1μg/réaction |
| ddH₂O | À 50 | - |
Note: a : Si elle est utilisée pour la qPCR/qRT-PCR, la sonde fluorescente doit être ajoutée au système réactionnel.Habituellement, une concentration finale d’amorce de 0,2 µM peut donner de bons résultats ;lorsque les performances de la réaction sont médiocres, la concentration de l'amorce peut être ajustée dans la plage de 0,2 à 1 µM.Habituellement, la concentration de la sonde est optimisée dans la plage de 0,1 à 0,3 μM.Des expériences de gradient de concentration peuvent être réalisées pour trouver la meilleure combinaison d’amorce et de sonde.
Remarques
1.L'enzyme UNG peut être utilisée pour éliminer les produits d'amplification dUTP contaminés du système de réaction avant la réaction d'amplification PCR, puis pour éviter des résultats faussement positifs dus à la contamination du produit.
2.La température optimale pour que l'enzyme UNG soit utilisée dans la réaction PCR anti-contamination est généralement de 50 ℃ pendant 2 minutes ;la condition d'inactivation est de 95 ℃ pendant 5 minutes.
3.Évitez les gels-dégels fréquents et ne les exposez pas à de grandes fluctuations de température.
4.Différents gènes à amplifier ont une efficacité d'utilisation différente du dUTP et une sensibilité à l'enzyme UNG. Par conséquent, si l'utilisation du système UNG entraîne une diminution de la sensibilité de détection, le système de réaction doit être ajusté et optimisé. Si vous avez besoin d'une assistance technique, veuillez contacter notre compagnie.
